在最近发表在PLOSOne杂志上的一项研究中，研究人员展示了一种与严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)nsp9复合的抗非结构蛋白9(nsp)特异性纳米体的晶体结构，他们将其命名为nsp9COV19。

研究揭示了SARSCoV2复制辅助因子非结构蛋白9中的一种新折叠

研究：由内而外：抗体结合揭示了SARS-CoV-2复制辅因子nsp9中潜在的折叠铰链点。图片来源：KaterynaKon/Shutterstock.com研究：由内而外：抗体结合揭示了SARS-CoV-2复制辅因子nsp9中潜在的折叠铰链点。图片来源：KaterynaKon/Shutterstock.com

Nsp9是一种小的辅助因子，在冠状病毒(CoV)复制和复制转录复合物(RTC)中起着至关重要的作用。此外，nsp9与nsp12的N末端假激酶Nidovirales核糖核酸(RNA)依赖性RNA聚合酶(RdRp)相关的核苷酸转移酶结构域(NiRAN)相关联，nsp12在宿主细胞内作为自切割PP1ab多聚蛋白产生。

Nsp12包含一个必需的病毒RdRp，它与nsp7和nsp8一起成为RTC核心组件。Nsp9具有独特的病毒折叠、RNA结合蛋白和病毒信使RNA(mRNA)加帽的关键元素。这种蛋白质还募集其他蛋白质用于病毒5'-mRNA加帽，这是病毒复制的一个重要方面，从而使nsp12成为一个潜在的可行治疗靶点。

在SARS-CoV-2加帽模型中，nsp9和NiRAN结构域共同充当多核糖核苷酸转移酶(PRNTase)，在不同的氨基酸链上具有催化和加合物接受残基。

VHH是骆驼免疫球蛋白(Ig)衍生的具有可变重结构域的纳米抗体。先前的研究表明，这些纳米抗体可能对nsp9具有高度特异性。同样，一些研究已经确定了许多对nsp9COV19具有亲和力的小分子，并有可能抑制NiRAN结合，从而防止SARS-CoV-2RNA化和加帽。

关于研究

在本研究中，研究人员描述了nsp9的灵活性。为此，纯化nsp9和抗nsp9VHH2nsp23复合物并在凝胶过滤上共复合。此后，使用X射线衍射以2.4Å的分辨率检查该复合物的晶体结构。

经过多轮研究，该团队最终构建并完善了nsp9COV19的VHH2nsp23结合态的晶体结构，该结构在不对称单元叠加内具有nsp9COV19:VHH2nsp23复合体的两个副本。

发现转化相关蛋白53(Trp-53)是nsp9COV19广泛的抗体结合界面的主要特征，其中CDR3环形成扩展的β-折叠相互作用。纳米抗体结合触发了nsp9独特的冠状病毒折叠的大规模拓扑变化，这扭曲了nsp9的所有NiRAN相互作用元素。

然而，尚不清楚VHH结合是否人为地诱导了这种结合状态，或者它是否是一种替代的预先存在的结构状态或仍然被困在nsp9中的折叠中间体。

Kleywegt图用于探索nsp9折叠内的潜在灵活性点，并比较nsp9COV19的结合和未结合状态。Ramachandran距离也被映射到nsp9COV19结构上的每个状态之间。

结果

nsp9COV19上的VHH2nsp23结合位点很广泛，其中VHHCDR2和VHHCDR3环内的残基分别占结合界面的27%和66%。

VHHCDR3残基103YYFST107与nsp9COV19s5链反平行并形成四个β-折叠氢(H)键。这些残基还与VHHThr-107建立了主链-侧链相互作用。此外，VHH2nsp23的VHHCDR2环贡献了完全由主链-侧链介导的大量接触。

nsp9COV19的Trp-53夹在VHHMet-50和VHHIle-52之间，两者都是疏水残基。八个表位特异性氢键、多个范德瓦尔斯相互作用和一个盐桥共同促成了VHH2nsp23的抗nsp9COV19特异性。

在VHH结合后，作者注意到nsp9COV19的天然非配体形式经历了一些结构重排。为此，观察到α-螺旋从迷你β-桶外和s2-s3和s4-s5环之间相距30Å的位置重新定位。尽管如此，nsp9COV19的大部分β结构元素仍处于拓扑附近的束缚态。

还确定了nsp9折叠内可能充当铰链点的其他结构点。例如，Leu-42在VHH2nsp23结合状态下驻留并形成标准的直链β链，而在apo状态下，Leu-42驻留于扭结点，从而使s3远离αC。αC的大规模移动主要是由VHH2nsp23直接接触的残基Lys-92/Gly-93中的主链转移促进的。

在病毒5'mRNA加帽期间，nsp9COV19的N末端插入nsp12NiRAN结构域，这是通过apo-nsp9折叠的特性介导的。这些特征包括GxxxG相互作用基序和投射到其活性位点的N末端。

s2-s3环的这种新构象状态和重新排列的αC扭曲元件接合

结论

结合表位VHH2nsp23通过用nsp9COV19解析其晶体结构来定义。正如之前在核磁共振(NMR)化学峰微扰分析中指出的那样，VHH2nsp23表位似乎靶向nsp9的s4和s5链内的残基，并特别关注Trp-53。额外的结构重排产生了nsp9COV19的VHH2nsp23结合结构。

nsp9的这种新的VHH2nsp23结合状态目前可能与生理学无关。然而，在失去Tyr摇篮后，它的形成为nsp9N末端提供了更多的自由。该结构在nsp9不同折叠内也有几个结构点，可能充当铰链点。因此，尽管发生在远离NiRAN相互作用位点的位点，但这些结构变化可能会破坏蛋白质界面。

nsp9COV19的这种新的VHH结合状态隐蔽地包裹着nsp9的C端α-螺旋，应该作为一种潜在的COVID-19治疗药物进行研究，因为它被证明可以限制NiRAN的参与，这可能会阻止SARS-CoV-2RNA化和5'mRNA加帽。